1樓：匿名使用者
bradford法的突出優點是：
（1）靈敏度高，據估計比lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合後產生的顏色變化很大，蛋白質－染料複合物有更高的消光係數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比lowry法要大的多。
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。
因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
（3）干擾物質少。如干擾lowry法的k 、na 、mg2 離子、tris緩衝液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測定法。
此法的缺點是：
（1）由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用於不同蛋白質測定時有較大的偏差，在製作 標準曲線時通常選用 g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去汙劑、 triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和0.1n的naoh。
（如同0.1n的酸干擾lowary法一樣）。
（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。
2樓：隗霓鄞葳
在酸性條件下，考馬斯亮蘭g-250染料與蛋白質疏水區結合，導致最大吸收峰由465
nm變為595
nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關係。將蛋白質樣品或稀釋的bsa
與bradford試劑混合，測量在595
nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的bsa建立的標準曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標準曲線而確定。
考馬斯亮藍g-250（coomassie
brilliant
blue
g-250）測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在遊離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合後變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。
蛋白質與考馬斯亮藍g-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法是2023年bradford建立，試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度範圍為0～1
000μg/ml，最小可測2.5μg/ml蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。
考馬斯亮藍有g250和r250兩種。其中考馬斯亮藍g250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍r250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。
考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：
該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去汙劑的濃度超過0．2%影響測定結果。
如tritonx-100、sds、np-40等。
1．bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍g-250溶於50ml
95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。
2．標準曲線蛋白質樣本的準備：儘量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之間繪製標準曲線。
3．將待測樣本溶於緩衝溶液中，該緩衝溶液應與製作標準曲線的緩衝溶液相同(最好用pbs)。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。
5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．
6．根據標準曲線計算待測樣本的濃度。
注意：考馬斯亮藍和**中蛋白質通過範德華力結合，反應快速，並且穩定，無法用普通試劑洗掉。待一兩週左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。
考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍g-250
定量結合。當考馬斯亮藍
g-250
與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從
465nm
變為595nm。在考馬斯亮藍
g-250
過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍
g-250
從吸收峰為
465nm
的形式轉變成吸收峰為
595nm
的形式，而且這種轉變有一定的數量關係。一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在
595nm
處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍
g-250
顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。長期以來，人們一直習慣用
lowry
法來測定蛋白質濃度，
但近些年來，
越來越多的人開始用考馬斯亮藍
g-250顯色法來測定蛋白質濃度，與
lowry
法相比，該方法具有下列優點：①方法簡單，只需一種顯色液。②反應迅速，只需一步反應，顯色可在
5min
之內完成。③干擾少，許多被認為對
lorwy
法有干擾的物質（如糖、緩衝液、還原劑和絡合劑）不影響該方法。儘管該方法有如此多的優點，但在實際應用中也有其缺點，如線性關係不很好，因此使用該方法測定蛋白質濃度時應特別注意。
3樓：
優點：染色簡單迅速，干擾物質少，靈敏度高。
缺點：一般風光光度法都有較大的機器誤差（重複性較差），為了資料準確需要每次進行標準曲線的測定。
生物測定常用試劑：sds和triton對該方法有干擾，限制了該法的使用。
常用來測定蛋白質含量的方法有哪些？優缺點是什麼？
4樓：王王王小六
1、凱氏定氮法
凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來併為過量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。
由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。
優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果準確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。
缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把**氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是一個用於鑑定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。
當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑑定反應的靈敏度為5-160mg/ml。
鑑定反應蛋白質單位1-10mg。
優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。
缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和edta等會干擾該反應。
3、酚試劑法
取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標準蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。
優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。
缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。
4、紫外吸收法
大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質溶液。
取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。
優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能**。
缺點：①測定蛋白質含量的準確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。
5、考馬斯亮藍法
考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍g-250 定量結合。當考馬斯亮藍 g-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。
在考馬斯亮藍 g-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 g-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關係。
一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 g-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。
優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、遊離氨基酸和緩衝劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。
缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。
5樓：其實不然
①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標準酸滴定硼酸，通過標準酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色複合物。
比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 tris 的干擾，但 準確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③folin酚法(lowry)
folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將cu2+還原成cu+， cu+能定量地與folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24e280-0.74e260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（coomassie brilliant blue g-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（cbg）染色法測定蛋白質含量。cbg 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 cbg接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 cbg一個較為中性的環境，因此會變成藍色。
當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的cbg也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥bca法
bca（bicinchoninc acid procedure，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使cu2+轉變cu+後，進一步以bca 取代folin試劑與cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中bca 比folin試劑穩定，因此bca與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及edta的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關係，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。
請問考馬斯亮藍R250和G250在用途上有什麼區別
朝華秋梵禕 1 考馬斯亮藍r250是通過範德瓦爾鍵與蛋白質結合，染色靈敏度比氨基黑高5倍，適用於sds電泳微量蛋白質染色。2 考馬斯亮藍g250在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色，所以常用於需要重複性好和穩定的染色，適於作定量分析。考馬斯亮藍r250 和g250其他的區別 1 ...