western blot用的一抗識別的是什麼表位的

時間 2021-09-07 15:16:01

1樓:匿名使用者

現在的市面上買的抗體很少是識別空間表位的

一般都是識別蛋白質一段保守的特異的氨基酸序列這個就足夠了

所以sds-page變性了之後還是能識別的

2樓:

誰說抗體都是識別空間表位的?

sds-page用的抗體就是識別線性表位的嘛

3樓:匿名使用者

一抗一般都是識別的氨基酸序列的

製作一抗時,就是把所要的蛋白質進行原核表達,表達完之後可以用柱子或磁珠進行純化,這種方法一般成本比較高。

還有一種方法就是把原核表達完的菌液收集菌體,超聲破碎,然後全部跑電泳(sds-page),之後用kcl染色(不是考染),將目的大小片段切下,用液氮研碎,加入pbs buffer,公司直接將這種糊狀的東西注射給兔子。大多數抗體公司都允許這樣做。

可見製作抗體時,抗原就已經變性了。

4樓:匿名使用者

多看看書吧。。。

雖然我做過多抗,也不是很瞭解原理。不過你說的什麼抗體都是識別空間表位的,那倒未必,因為我看到過是有識別線性表位的。而且我們跑了sds-page之後切膠免疫家兔,明顯都是變性過後的。

而且據我所知,現在有的公司做的抗體都是用某個蛋白n-或者c-端比較保守的幾個氨基酸序列,通過合成這幾個氨基酸,與bsa還是什麼結合(不好意思,本科畢業都3年了,說錯不負責啊),不過那個大分子好像是免疫原性比較低,我覺得那幾個氨基酸也不可能會有正確的如原來蛋白的空間表位吧。

小木蟲我不怎麼上。多去丁香園吧。不過我畢業後也再沒上過了。我本科畢業的時候倒是經常去中國生命科學論壇,現在好冷清啊。喜歡丁香園,哈哈。

western blot出現很多雜帶,求助,交流

5樓:武漢博歐特生物

1.因為wb的一抗識別的蛋白質的表位是順序表位,不是空間表位,所以wb狀態下的抗原-抗體識別,與非變性的生理條件下的抗原-抗體識別不同。

2.wb之前,先用分子篩純化同時也是檢測一下目的蛋白產物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表達了,而且在提取後穩定存在了。

3.非特異性的條帶分子量偏大可能是sds page出的問題,膠的濃度不合適或者樣品溶解度不夠或者電泳時間不合適等,造成了目的條帶的表觀質量變大。

4.三個非特異性的分子量偏大條帶之一可能是目的蛋白在sds page出的問題出了問題,另外兩個帶可能本來就是雜帶了。可以**後對三條帶用質譜檢測精確的分子量加以確定。

5.三個非特異性的分子量偏大條帶至少應該有雜帶,雜帶出現而且與一抗相互作用,那麼只能說雜帶的順序表位也能被一抗識別,必須更換專一性更高的抗體。

6.還有考慮你的鎳柱親和分離的問題,是不是獲得了你的需要的目的蛋白質。

western blot 為什麼要用二抗?直接標記一抗不行嗎?

6樓:螞蟻

之所以用二抗,是因為二抗是帶有酶標的抗體,它跟一抗結合之後可以**顯影。如果你的一抗上面直接帶有酶標物,那可以不用二抗直接**。但是一般你的一抗都是少數應用的,廠家不會大批量生產,就不會費勁給它加酶標。

7樓:匿名使用者

一方面是為了顯影啥的 主要還是是為了增強特異性 放大訊號

免疫組化和westernblot的一抗有什麼區別

western blot中,封閉液封閉完成後,需要用pbs或pbst洗滌濾膜,然後進行一抗孵育

8樓:

封閉完可直接一抗孵育 一抗完了用pbst洗三次後二抗孵育 離子濃度肯定會對抗體結合有影響啦

9樓:匿名使用者

就是洗疊氮鈉和非特異結合的一抗的,磷酸鹽只是緩衝環境,當然有人不喜歡用pbst洗,有人用tbst洗,就是一個磷酸鹽緩衝環境和tris的緩衝環境而已,個人喜好。

10樓:匿名使用者

一抗孵育完成後洗膜是為了洗掉未和膜結合的抗體,而不是磷酸鹽。只有洗乾淨非特異性結合在膜上的一抗,加二抗時才不會因非特異結合而呈現很重的背景。至於是使用pbs(t)還是tbs(t),這要具體看你的二抗種類。

pbs不適合ap系列,pbs/tbss適合ap和hrp體系。另外,做磷酸化蛋白的wb,pbs不合適.

11樓:天箭

一抗孵育完了要用pbst或tbst洗掉未結合抗原的一抗,一抗不洗乾淨顯色以後背景會很重。

12樓:百浩生物

有可能你看錯了,就一般的理解,是沒有必要的,tbst並不是洗磷酸鹽。或者二抗是ap標記的才要洗磷酸鹽。

hrp標記的二抗,就算是用pbst洗,也是可以的。因為二抗可以用pbs稀釋。洗去pbs是沒有意義的。

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關於紋身抗不抗的動懂得來,謝謝,關於紋身抗不抗的動懂得來,謝謝

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