1樓：禾鳥
1、退火溫度低於引物tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值（tm值=4(g+c) +2(a+t)）為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
擴充套件資料
pcr的過程：
1、dna變性：（90℃-96℃）：雙鏈dna模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈dna
2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與dna模板結合，形成區域性雙鏈。
3、延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的dna鏈。
2樓：匿名使用者
退火溫度一般是比你設計引物時的tm值低5度。不過這是要摸索的，用溫度梯度pcr。（順便說一下，如果你不想花時間摸索溫度，建議就用60度。
這個溫度是我原來做實驗時的萬能溫度。尤其對較短片段pcr適用）
延長時間是看pcr產物長度，一般認為常規taq酶一分鐘擴增1kb。比如你的pcr產物是500bp，你就用30秒。不過我一般會在這個基礎上再加5秒左右。
pcr反應退火溫度的高低與什麼因素有關
3樓：我的行雲筆記
退火溫度是影響pcr反應特異性的重要因素。
引物與模板復性所需要的退火溫度取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度。引物長度越短，引物中g+c的含量越低，所需的退火溫度越低。雖然降低退火溫度可能增加擴增產量，但引物與模板間的錯配現象也會增多，導致非特異性擴增上升。
相反，提高退火溫度雖然可以提高反應的特異性，但會引起擴增效率下降，甚至無擴增產物出現。引物的退火溫度可以通過tm=4(g+c)+2(a+t)公式組略估算，一般在算出的tm值上減去5攝氏度極為較合適反應設計退火溫度。
pcr的退火溫度怎麼設定
4樓：匿名使用者
pcr中退火的那步是引物與模板結合，一般來說，退火溫度比tm值要低上5度左右。另外，也可以根據你設計引物的軟體比如primer5.0或olige 6 推薦的溫度。
但這些都不是絕對的。你要是在他的推薦溫度下沒有目的條帶，你可以試試做一個溫度梯度，摸索一下退火溫度。
5樓：匿名使用者
在pcr儀上 程式設計的時候，一步一步的設定，設定完變性的引數，接著就是退火的引數啊。。
6樓：
一般用55°，不行的話用58°，再不行的話就設定從58-55的touchdown
7樓：草清河
一般設定的為64度左右
8樓：竹長菁淦縈
熔解溫度（tm）是引物的一個重要引數。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈dna分子時的溫度.tm對於設定pcr退火溫度是必需的。
在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，
同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的
tm低5℃。
設定tm有幾種公式。有的是**於高鹽溶液中的雜交，適用於小於18鹼基的引物。
有的是根據gc含量估算tm。確定引物tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰鹼基的特性**引物的雜交穩定性。大部分計算機程式使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。
開始低於估算的tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的tm值。引物對的tm差異如果超過5℃，就會引物在迴圈中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物tm不同，將退火溫度設定為比最低的tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據較高tm設計的退火溫度先進行5個迴圈，然後在根據較低tm設計的退火溫度進行剩餘的迴圈。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
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