引物設計原則是什麼?引物設計的引物設計原則

時間 2023-05-31 20:06:08

1樓:帳號已登出

一、引物設計有3條基本原則:

1、引物與模板的序列要緊密互補。

2、引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構。

3、再次引物不能在模板的非目的位點引發dna聚合反應(即錯配)。

二、pcr引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段,使其能有效地擴增模板dna序列。如前述,引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保pcr的成功,但遵循某些原則,則有助於引物的設計。

2樓:匿名使用者

1、引物的長度一般為15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不應大於38,因為過長會導致其延伸溫度大於74℃,不適於taq dna聚合酶進行反應。

2、 引物序列在模板內應當沒有相似性較高,尤其是3』端相似性較高的序列,否則容易導致錯配。引物3』端出現3個以上的連續鹼基,如ggg或ccc,也會使錯誤引發機率增加。

3、引物3』端的末位鹼基對taq酶的dna合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率,末位鹼基為a的錯配效率明顯高於其他3個鹼基,因此應當避免在引物的3』端使用鹼基a。

引物設計的引物設計原則

3樓:諾諾百科

1、引物長度一般為15-30bp,常用的為18-27bp,但不能大於38bp;

2、引物gc含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,上下游引物gc含量和tm值要保持接近;

3、引物所對應的模板序列的tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之間,tm值曲線以選取72度附近為佳,5'到 3』的下降形狀也有利於引物與模板的結合;

4、引物之間:兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基,不然會形成引物二聚體,尤應避免3』端的互補重疊。

4樓:匿名使用者

1、長度:15—30bp,其有效長度[ln=2(g十c)十(a十t)]一般不大於38,否則pcr的最適延伸溫度會超過taq酶的最佳作用溫度(74度),從而降低產物的特異性。

2、g十c含量:應在40%一60%之間,pcr擴增中的復性溫度一般較tm值低等於引物的tm值減去5—10度。引物長度小於20時,其tm恆等於4×(g十c)十2×(a十t)。

3、鹼基分佈的隨機性:應避免連續出現4個以上的單一鹼基。尤其是不應在其3』端出現超過3個的連續g或c,否則會使引物在g十c富集序列區錯誤引發。

4、引物自身:不能含有自身互補序列,否則會形成髮夾樣二級結構。

5、引物之間:兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基,不然會形成引物二聚體,尤應避免3』端的互補重疊。

6、上下游引物的互補性:一個引物的3『末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。

末端:如果可能的話,每個引物的3『末端鹼基應為g或c。

8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。

如何設計引物?

5樓:鮮活且善良丶桃花

2.在框中貼上入你的原始序列(要比你要擴的目的片段兩端延伸一點)

3.在框的下方有許多可以設定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進行設定。

同時引物設計和選擇目的dna序列區域時可遵循下列原則:

1) 引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。

2) 引物中g+c含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 tm=4(g+c)+2(a+t).

3) 四種鹼基應隨機分佈,在3'端不存在連續3個g或c,因這樣易導致錯誤引發。

4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應,以減少由於密碼子擺動產生的不配對。

5) 在引物內,尤其在3'端應不存在二級結構。

兩引物之間尤其在3'端不能互補,以防出現引物二聚體,減少產量。兩引物間最好不存在4個連續鹼基的同源性或互補性。

7) 引物5'端對擴增特異性影響不大,可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護鹼基。

引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構,以免產生非特異性擴增,影響產量。

9) 簡併引物應選用簡併程度低的密碼子,例如選用只有一種密碼子的met,3'端應不存在簡併性。否則可能由於產量低而看不見擴增產物。

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