1樓：劉家小妮兒
1.用水不會有太大影響，只是質粒在水中儲存不如在elution中穩定，最好還是用試劑盒的elution；2.你提的質粒是連有目的基因的話，可以空載在前，中間是marker，後邊重組質粒，一般如果目的基因比較小的話，不會有太多區別，可以雙酶切後看條帶數：
重組質粒酶切後有兩條帶。3.一般酶切建議：
37°c，3-4小時
2樓：
我覺得用elution buffer沒太大的影響，如果你非要覺得不好的話，只能在轉化一遍重新提質粒或者抽成乾粉再加水。我們一般用水就行。實在不行去測序呀。
提的質粒和空質粒可以比較，如果你插入的基因足夠大，實在不行多跑跑。然後看大小比較。
酶切的話還是要看你的酶的活性。要是快切酶的話只要五分鐘，要是慢的話要三四個小時。（我用的是takara的） 是不是你酶切的量太少了，我一般50ul的體系要酶切1ug以上的，還要多跑跑，跑個十分鐘以上吧。
我也做了個克隆用了很長時間，實在不行就買點貴的酶，能保證一次成功呀。
挑克隆鑑定時pcr有目的條帶但是酶切沒有 50
3樓：匿名使用者
可能原因：
1.pcr擴增的是假克隆，因為pcr驗證的可靠性不穩定。
2.質粒中酶切位點變異
你可以做如下實驗：
1.看重組質粒的大小是不是比原始質粒大
2.用提出的質粒做pcr，這樣比較可靠，用細菌做pcr的假陽性極高3.用別的酶再試一下，是否能切出目的片段。
祝實驗成功
4樓：
2中可能，1種是你的抗生素失效了，長出來都是沒質粒的菌；另1種是你轉化進感受態的都是空質粒。
pcr擴增有目的條帶可能是因為連線產物殘留的pcr片段在平板上引起的假陽性。
5樓：匿名使用者
1)把提取的質粒和空質粒一起電泳 看是不是比空質粒大或者找一個質粒上的酶切位點酶切提取的質粒和原始質粒 再電泳觀察提取的質粒是否比原始質粒大
2)菌液pcr的假陽性經常出現 用質粒pcr擴增看是否有目的條帶3）最直接的辦法就是去測序了 一兩天的時間就出結果 一個反應二三十元 很方便
6樓：國際不配叫米蘭
單酶切切還是雙酶切??菌落pcr不是很準確,單酶切是應該只有一個目的條帶啊,你其額定酶是好的嗎??同意提質粒做pcr
pcr產物和質粒雙酶切後電泳如何判斷酶切完成？
7樓：35豆豆
pcr產物酶切後不能判斷是否完全..
質粒如果切下來的片斷不是很小,可以取少量進行電泳檢視條帶..如果沒有完全酶切,大條帶會出現單酶切的產物條帶.
8樓：匿名使用者
你是不是要把雙酶切後的質粒與載體連線，而無論是pcr還是載體都無法通過電泳判斷是否酶切完全，所以不好進行連線呀？對於pcr產物一般會採取這樣的策略，將產物首先連線到t載體上，然後再用設計好的雙酶切，電泳**切下的條帶，這樣就能確保得到的是完全酶切的產物。載體判斷比較麻煩，要看載體本身、多大雙酶切為點之間的條帶有多大、雙切前後的大小是否能通過電泳區別出來，但是雙切位點一般都在標記基因裡面，所以插入片段的載體會在後期轉化可以後區分開，所以也沒有太大必要確定他是否完全，只要充分酶切就好了。
9樓：百浩生物
這個一般酶切一到兩個小時就結束。再去電泳分離，將你要的片段（根據理論大小）切膠**。
因而你不用去判斷是否酶切完成或者完全酶切開了（只要90%或者以上的都切開就行了）。如果你非要百分之百的切開，可能電泳也難以檢測。而且意義不大。
如果你想節省內切酶，也可以切過夜。不過如果你的質粒提的質量不高，可能讓質粒降解。一般兩個小時足夠了。
10樓：
1、你的實驗目的是什麼？
2、如果是克隆，連線t載體後不用酶切，直接轉化菌落pcr檢測有目的條帶的話送樣測序即可。
3、如果是做表達載體構建，pcr產物和質粒dna酶切後與沒有酶切的在同一塊膠上電泳，如果兩個酶切位點很近，幾乎看不到被切下來的小片段條帶（太小，早就跑出去了）。你要是怕酶切不完全就多稍微加點酶，切的時間長一點。
4、關於酶切產物有幾條帶視酶切效果而定，酶切完全則兩條，一大一小（小的可能看不到，原因見3、）酶切不完全則三條帶，一大一小及未切開的pcr產物；質粒的話可能還多一條環狀分子和線狀分子的區別。
質粒連線目的片段，菌液pcr後電泳有目的條帶，為什麼送菌液測序結果是空載體呢 ？
11樓：exo不偷井蓋
1、你bai
的實驗目的是什麼？ 2、如果du是克zhi隆，連線t載體後不用酶dao
切，直接轉化菌專落pcr檢測有目屬
的條帶的話送樣測序即可。 3、如果是做表達載體構建，pcr產物和質粒dna酶切後與沒有酶切的在同一塊膠上電泳，如果兩個酶切位點很近，幾乎看不到被切下來的小片段條帶（太小，早就跑出去了）。你要是怕酶切不完全就多稍微加點酶，切的時間長一點。
4、關於酶切產物有幾條帶視酶切效果而定，酶切完全則兩條，一大一小（小的可能看不到，原因見3、）酶切不完全則三條帶，一大一小及未切開的pcr產物；質粒的話可能還多一條環狀分子和線狀分子的區別。
12樓：落葉來也
確定有目的條帶麼?
如果確定連上了，可能就是挑菌的時候不是單菌落，重新挑，或者原點再取點，塗布或者劃線。
我擴增的菌液能擴增出來條帶，但是做酶切切不出來目的條帶？怎麼回事
13樓：匿名使用者
pcr反應的關鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④pcr迴圈條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除淨，特別是染色體中的組蛋白，④在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物***時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程式亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝儲存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特 異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
做重組質粒時，轉化提質粒後PCR驗證為陽性，但是酶切卻切不出
匡雅霜 pcr驗證時常呈假陽性，以酶切驗證為準。或者你可以送去測序。 你可以送去測序看看 如果測序結果證明你的質粒對的話 可以更換酶切體系 質粒最好濃多點 時間 如果還不行，就重新買內切酶試試吧 我當初就是切不出來後 換了體系，延長時間 過夜最佳 就有了，比較淡而已 酶切體系是否合理，酶切時間是否足...
pcr擴增後沒有條帶是怎麼回事，PCR擴增後沒有條帶是怎麼回事
墨汁諾 pcr的反應條件與很多引數有關係。如模板濃度，引物長度及gc含量，引物濃度，dntps濃度，選用的taq enzyme,緩衝液的離子含量，產物大小，變性時間，退火溫度及時間，延長的時間。物理原因 變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性 退火溫度過低，可致非...
PCR和實時熒光定量PCR這兩種有什麼區別
仇淑珍展月 實時熒光定量pcr技術，是指在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。pcr 聚合酶鏈式反應 是利用dna在體外攝氏95 高溫時變性會變成單鏈，低溫 經常是60 c左右 時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調...